Om de volksgezondheid beter te kunnen beschermen, is er in de drinkwatersector behoefte aan snelle screening van micro-organismen. De Polymerase Chain Reaction (PCR) stelt ons in staat om DNA van de indicatorbacteriën E. coli en enterococcen binnen enkele uren aan te tonen. Met PCR wordt echter niet duidelijk of de pathogenen nog levensvatbaar zijn. Daarnaast kunnen humuszuren of metaaldeeltjes de analyse verstoren en leiden tot vals-negatieve resultaten: de pathogene bacterie is er wel maar het monster geeft toch een negatief PCR-resultaat. Dergelijke verstoringen maken het moeilijk om met PCR pathogene bacteriën in lage concentraties te detecteren. In de levensmiddelendiagnostiek, met dagelijkse controles van producten, zijn daarom methoden als voorkweek-PCR ontwikkeld. Voorkweek methoden hebben een lagere detectiegrens en beperken de effecten van humuszuren, deeltjes of andere stoffen in de matrix. Bovendien beperken ze de kans op vals-positieve detectie (dode cellen). Vitens WEC onderzocht de toepassing van voorkweek- PCR voor het screenen op fecale verontreinigingen in drinkwater. Hiertoe is een voorkweek-PCR procedure voor E. coli en enterococcen ontwikkeld en gevalideerd volgens het NEN-EN-ISO16140-protocol. Daarbij is ook gekeken of de methode gevoelig is voor verstorende stoffen in drinkwater. Gestandaardiseerde kweekmethoden voor de detectie van E. coli en enterococcen in drinkwater zijn als referentie gebruikt. Deze standaarden zijn gebaseerd op NEN-EN-ISO richtlijnen voor bepalingen van E. coli en enterococcen) bij drinkwateronderzoek. De betreffende analyse op E. coli duurt 24 uur en die op enterococcen maar liefst 48 uur. Ze zijn door de overheid in de drinkwaterregeling opgenomen en zijn momenteel de standaard voor controle van E. coli en enterococcen.
Voorkweek-PCR
Bij voorkweek-PCR wordt het DNA van een doelorganisme in twee stappen vermenigvuldigd en onderzocht. In de eerste stap worden doelorganismen in het monster onder gecontroleerde omstandigheden opgekweekt (voorkweek). Vervolgens is detectie met PCR relatief eenvoudig. De voorkweek verloopt als volgt: we filteren 200 milliliter drinkwater. Hierna wordt het filter 9 uur geïncubeerd in een generiek vloeibaar medium bij 37 °C, om E. coli en enterococcen te vermeerderen. S. epidermidis wordt als controle toegevoegd. Na incubatie volgt de isolatie van DNA uit het voorkweekmedium, waarna met PCR het DNA van de fecale indicatororganismen en S. epidermidis wordt vermenigvuldigd en gedetecteerd. De methode is kwalitatief: hij detecteert dus kweekbare E. coli, enterococcen en S. epidermidis, maar geeft geen informatie over het aantal kolonievormende eenheden of DNA-kopieën. In afbeelding 1 wordt een voorbeeld weergegeven van een uitslag van de voorkweek-PCR.
Validatie van de voorkweek-PCR
Ter validatie zijn de selectiviteit, gevoeligheid en juistheid, en de detectielimiet van de voorkweek-PCR bepaald met drinkwater als matrix. We vergeleken de resultaten van de voorkweek-PCR met die van de standaard kweekmethodes. De toegepaste voorkweek-PCR bleek selectief: 89 referentiestammen van enterococcen en E. coli gaven een positieve uitslag terwijl 34 andere stammen (geen enterococcen of E. coli) een negatieve uitslag gaven. Bij de vergelijking met de standaard methodes (gevoeligheid en juistheid) werden 134 monsters getest, waarvan 64 opzettelijk waren gecontamineerd met E. coli en/of enterococcen. 27% van de monsters bevatte E. coli en 37% bevatte enterococcen. De resultaten van de validatie zijn weergegeven in Tabel 1.
Voor betrouwbare validatie zijn internationale normen beschreven. Vaak gebruikt men daarbij de norm NENEN- ISO 16140. Volgens deze norm mag het verschil (acceptabele limiet) tussen de voorkweek-PCR en de standaard kweekmethode niet groter zijn dan 4. Het resultaat voor de limiet bij onze vergelijking was voor beide organismen 1, wat betekent dat de resultaten van de voorkweek-PCR overeenkomen met die van de klassieke kweekmethoden en dus aan de norm voldoen. Voor de detectielimiet van de voorkweek-PCR hebben we lage verontreinigingsniveaus onderzocht met zowel de voorkweek-PCR als de standaard kweekmethoden (zie tabel 2).
Validatie van de voorkweek-PCR
Ter validatie zijn de selectiviteit, gevoeligheid en juistheid, en de detectielimiet van de voorkweek-PCR bepaald met drinkwater als matrix. We vergeleken de resultaten van de voorkweek-PCR met die van de standaard kweekmethodes.
De toegepaste voorkweek-PCR bleek selectief: 89 referentiestammen van enterococcen en E. coli gaven een positieve uitslag terwijl 34 andere stammen (geen enterococcen of E. coli) een negatieve uitslag gaven. Bij de vergelijking met de standaard methodes (gevoeligheid en juistheid) werden 134 monsters getest, waarvan 64 opzettelijk waren gecontamineerd met E. coli en/of enterococcen. 27% van de monsters bevatte E. coli en 37% bevatte enterococcen. De resultaten van de validatie zijn weergegeven in Tabel 1.
Voor betrouwbare validatie zijn internationale normen beschreven. Vaak gebruikt men daarbij de norm NENEN- ISO 16140. Volgens deze norm mag het verschil (acceptabele limiet) tussen de voorkweek-PCR en de standaard kweekmethode niet groter zijn dan 4. Het resultaat voor de limiet bij onze vergelijking was voor beide organismen 1, wat betekent dat de resultaten van de voorkweek-PCR overeenkomen met die van de klassieke kweekmethoden en dus aan de norm voldoen. Voor de detectielimiet van de voorkweek-PCR hebben we lage verontreinigingsniveaus onderzocht met zowel devoorkweek-PCR als de standaard kweekmethoden (zie tabel 2).
Het experiment laat zien dat E. coli en enterococcen- soorten in lage hoeveelheden (0,7 kve en 1,5 kve/100 ml) met de voorkweek-PCR vaker worden aangetoond dan met de klassieke kweekmethoden. Om de gevoeligheid van de voorkweek-PCR voor PCR-remmende stoffen te bepalen zijn nog eens 28 drinkwatermonsters getest. De meeste monsters waren gecontamineerd met lage concentraties E. coli en enterococcen. De resultaten van de voorkweek-PCR en de standaard kweekmethoden kwamen bij deze 28 geteste monsters nagenoeg overeen. Eén monster testte negatief met de voorkweek-PCR en positief met de standaard methode (waarbij 1 kve/100 ml E. coli werd aangetoond). Dit verschil kan mogelijk worden verklaard als gevolg van pakkans van kweekbare organismen in het bemonsterde water. De conclusie van dit experiment is niettemin dat de voorkweek-PCR niet gevoelig is voor PCR-remmende stoffen, en de kans op een vals negatief resultaat is klein.
Toepassing bij andere bacteriën
Na onderzoek aan fecale indicatororganismen is ook verkend of de voorkweek-PCR geschikt is voor bepalingen van Clostridium perfringens en coliforme bacteriën. Een kleine studie van Vitens WEC toonde aan dat thermotolerante coliformen Klebsiella, Enterobacter en Citrobacter kunnen worden gedetecteerd met de voorkweek-PCR. Hoewel voorkweek-PCR nog verbetering vereist, is het perspectief hoopgevend: met één voorkweekmedium kunnen in potentie thermotolerante coliformen, enterococcen, E. coli en C. perfringens worden gedetecteerd. Dit bespaart kweekmedia, kosten en het gebruik van plastics, waardoor de voorkweek-PCR duurzamer is dan klassieke gestandaardiseerde kweekmethoden. Tenslotte werkt Vitens WEC ook aan een voorkweek-PCR methode waarmee binnen 48 uur levensvatbare L. pneumophila kan worden gedetecteerd. Hiermee kan een tijdswinst worden geboekt van maar liefst 5 dagen ten opzichte van de klassieke methode en ook hiervan zijn de eerste resultaten veelbelovend.
Mogelijkheden voor inzet voorkweek-PCR voor drinkwateronderzoek
In dit onderzoek onderzochten we of een voorkweek-PCR methode uit levensmiddelenonderzoek geschikt is voor het screenen van drinkwater op E. coli en enterococcen. De validatie toonde aan dat de voorkweek-PCR vergelijkbaar presteert met standaard kweekmethoden en niet gevoelig is voor storende stoffen in drinkwater. De methode is eenvoudig te automatiseren, wat interessant is voor Vitens WEC, dat dagelijks meer dan 200 monsters test. De voorkweek-PCR kan binnen 10 tot 12 uur resultaten opleveren, wat een aanzienlijke tijdswinst is ten opzichte van de gestandaardiseerde kweekmethoden die 1-2 dagen kosten. De methode is effectief in het detecteren van lage hoeveelheden fecale indicatororganismen. Voorkweek-PCR biedt een snel en accuraat alternatief voor routinematig drinkwateronderzoek. De conclusie is dat de voorkweek-PCR een snel, eenvoudig en duurzaam alternatief kan zijn voor de huidige kweekmethoden voor de screening van (fecale indicator) organismen. Het doel is om voorkweek-PCR methodes verder in te zetten en kennis te delen over de mogelijkheden ervan. Daarnaast willen we deze methodes verder standaardiseren, zodat ze ook beschikbaar zijn voor andere geïnteresseerde bedrijven, net zoals in de voedingsmiddelenbranche is gebeurd.
Voorkweek-PCR is een techniek uit de voedingsdiagnostiek voor de snelle screening van levensvatbare pathogene bacteriën. Onderzoek van het Vitens Waterexpertisecentrum (WEC) wees uit dat deze methode ook geschikt is voor de screening van (drink)water. In het onderzoek wordt drinkwater gefilterd, het filter wordt in een groeimedium geïncubeerd, waarna een DNA-analyse met PCR volgt. Vergeleken met de standaard kweekmethoden bespaart voorkweek- PCR, tijd, kweekmedia, kosten en het gebruik van plastics.